大沽口事件激起了中国人民莫大的愤怒，3月14日，北京举行了30万人参加的反日大会。3月17日，李大钊亲自率领北京全市各学校、各团体的代表团100多人分别到外交部和国务院去请愿，要求段政府“驳复最后通牒”，驱逐签署最后通牒的八国公使出北京。但是，以卖国为能事的段政府，竟用刺刀回答了人民的要求，当场刺伤多人，揭开了第二天大屠杀的序幕。
3月18日，李大钊又亲自领导200多个社会团体，10多万群众，齐集天安门前，举行反对八国最后通牒的示威大会。会场上挂起了昨天请愿受伤代表的血衣，写着“段祺瑞铁蹄下之血”8个大字。李大钊是大会主席之一，他发表演说，号召大家用“五四”的精神，“五卅”的热血，不分界限地联合起来反抗帝国主义的联合进攻，反对军阀的卖国行为。斑斑血迹，慷慨演说，无不使群众热血沸腾，义愤填膺，当即一致通过了驳回最后通牒和驱逐八国公使等决议。
会后，又组织2000多人的请愿团，再次到执政府去请愿。在群众进入执政府门前的广场后，段祺瑞的军警就封闭了广场上仅有的两个出口，血腥的大屠杀随即开始了。军警用排枪，用刺刀、马刀，灭绝人性地射击砍杀群众，一时血流满地，惨不忍睹，死者47人，伤者200多人，这一天成了“民国以来最黑暗的一天”。
李大钊在请愿时，走在最前面，以致头部和双手负伤，并曾一度被捕，因回答机警脱险后，仍不顾个人安危，镇静地指挥和掩护群众撤退，直到枪声响过半个小时后，他才随着最后一批群众撤出广场。
“三·一八”当晚，李大钊立即召开党团会议，布置如何慰问伤者，追悼死者，如何揭露段祺瑞的凶残，把斗争坚持到底。惨案的第二天，北京各校都停了课，许多学校为死难烈士开了追悼会。3月23日，北京市总工会、学联等团体，联合在北大举行追悼大会，会场高悬“先烈之血，革命之花”8个大字。会上，有的爱国青年咬破手指，扯下衣襟，写下血的誓言。党中央为“三·一八”惨案发表了告全国人民书，强调指出：“唯一的办法只有实际的行动。民众立即起来团结武装和革命。”
“三·一八”运动虽然被帝国主义及其走狗镇压下去了，但是，正如李大钊当时所指出的：“帝国主义对中国民族的压迫，只有日益增加，故中国民族之革命运动，亦只有从之而日益强烈到处都有中国民众被屠杀于他们所谓‘秩序’之下的血迹，即到处都有中国民众反抗列强的斗争。因为对于压迫的还答，只有反抗，对于他们镇压我们的‘秩序’的酬应，只有我们反抗他们秩序的骚乱，这便是革命。”
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