接到作战命令后，俊六开始积极进行进攻武汉的作战准备。他先是派兵拿下了军事重镇安庆，以方便日军的战斗机从此起飞，轰炸汉口。随后，6月底，?俊六在“安宅”号军舰上与中国方面舰队司令官及川古志郎交换了《关于汉口攻略作战的陆海军协定备忘录》，与海军达成共同作战的协定，由海军负责打通长江水路交通，沿长江运送陆军。
7月19日，日军进攻黄梅。7月23日，日军主攻部队在姑塘登陆。7月26日，攻占九江。8月1日，占领黄梅。
与此同时，日军进犯苏联边境的“张鼓峰事件”以日军败北、外交谈判而告终。对苏此役，日军第十九师团几乎被全歼，但日军也探测到了苏联对日本侵占中国的实际态度。因而，日军更加放心大胆地进行攻占汉口的准备。
作为华中派遣军司令官的俊六率其所属14个师团和1个航空兵团的兵力投入这场战争。俊六进行了具体的部署，他命令东久迩宫稔彦王中将所率第二军、第三、第十、第十三、第十六师团向庐州附近集结；命令冈村宁次中将所率第十一军的第六、第九、第二十七、第一○一、第一○六师团和精锐波田支队向黄梅、九江附近靠拢；将德州好敏中将的航空兵团基干兵力纳入部署，以抢占制空权。为了保证不“后院起火”，俊六又将5个师团的兵力布置在上海、南京、安庆等已占领地区。
以俊六为首的参与武汉会战的主要日军将领8月22日，日军大本营下达了由华中派遣军协同海军进攻武汉的作战命令。接到命令后，俊六立即指挥华中派遣军兵分两路、南北夹击，一路从长江北岸直击汉口，一路从大别山脉北部迂回进击汉口北。
武汉三镇战略地位极为重要，它位于江汉水系的汇合处，是重要的工商业城市和交通枢纽，素有“九省通衢”之称。同时，国民政府在南京失陷后就撤退到武汉，中国共产党也在武汉设有长江局，因而，武汉是当时领导全中国抗战的中心。
中国军队投入近60个师的兵力进行武汉会战。以第五战区军队组成左翼兵团，在孙连仲的指挥下，防守长江以北地区；以第九战区军队组成右翼兵团，在陈诚的指挥下，防守长江以南地区。
俊六命第二军8月27日从合肥出发，沿大别山一线进攻，首先占领光州、高城等地。随后分兵三路前进：右路进攻六安、固始、商城等地；左路进攻罗山、信阳等地；中路沿江进攻宿松、广济等地。时值酷热暑天，加之山地作战，面对中国军队的英勇抵抗，日军遭受重创。为了摆脱困境，日军竟大规模施用毒气。在付出巨大代价之后，才于10月底陆续占领了信阳、应山及安陆等地。
从南路奉俊六之命进攻武汉的第十一军，力攻要塞马头镇和田家镇，企图打开通往武汉的大门，受到中国军队的拼死抵抗。
第一○一师团8月下旬就开始进攻庐山地区的中国守军阵地，一个多月的苦攻都未能攻下，直到10月25日，汉口失守，中国守军主动撤退，日军才得以占领德安。
第一○六师团企图从五台岭攻入德安西南地区，威胁德安附近的中国军队，却被中国军队团团包围在五台岭附近，被围10多天，直到10月17日以后才被赶来的援军救出。但损失惨重，已丧失了继续作战的能力。
有精锐之称的日军波田支队与第九、第二十七师团从瑞昌出发，分头进攻武昌及粤汉线沿途各地，也遭到中国军队的顽强抵抗，平均每天只能推进两三公里。经过一番苦战，10月21日波田支队攻入大冶，26日进占武昌；第九师团26日突破中国守军阵地，进占贺胜桥；第二十七师团10月5日占领箬溪后，向咸宁进犯。
俊六所率南北两路日军此时均已突入武汉外围，武汉外围已无险可守，国民政府不得不放弃武汉，退至重庆。10月26日，俊六率军占领武汉，同时，华中方面军司令部改迁汉口。11月2日，又立“功勋”的俊六乘军舰走水路耀武扬威地抵达武汉。
在武汉会战中，俊六所率华中派遣军为了取得侵略战争的胜利，悍然践踏《日内瓦协议书》和《国际法》原则，多次使用毒气。据日本自己的报纸《朝日新闻》报道，进攻武汉时，日军共使用毒气375次，发射毒气弹4万颗以上。
这群兽军不仅在战场上凶残无道，而且面对手无寸铁的中国平民，亦杀人放火、奸淫掳掠，桩桩罪行，无所不用其极。日军对武汉平民恣意滥杀，武汉的主要街道上满是被日军残杀的体无完肤的中国人的尸体；长江上漂浮着密密麻麻的尸体，江水都变成了红褐色。许多妇女被日军奸污之后，挥刀砍死。
在武汉下新河的一个防空壕内，后来人们发现了十多具裸体的女尸，她们全是被日军奸污后杀死的。更有甚者，在汉口花旗银行旁，3名日本宪兵光天化日之下公然强奸一名妇女。花旗银行的一名外国职员亲眼目睹后极为气愤地说：“这还是日本的宪兵，宪兵尚且如此，其他的士兵还能不成为强盗吗!”
到处放火抢劫是这伙兽军的又一大能事，到处是纵火抢劫的日本士兵。市区繁华的民权路、民族路一带被日军放火烧成一片瓦砾，从大火中逃生的平民无家可归而流落街头。俊六作为统帅不仅不制止，竟然还纵容和支持日军的这些暴行。甚至为了鼓励部下的抢劫，俊六进驻汉口后，马上下令开设一个“汉口野战邮局”以帮助部下存汇劫掠而来的赃款。据该邮局局长对当时东京《朝日新闻》报社的记者供称，从日军1938年10月25日占领汉口到11月25日，仅一个月内，邮局所存汇日军士兵的款项，折合日币就达60万日元(按现在币值计算约合十八亿日元)。这还仅仅是日本士兵而不包括军官在内，军官抢劫的款额数目则更大。可见这群日本兽兵在武汉疯狂劫掠，数额之巨，程度之烈。
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