周士第率领第25师从南昌南下后，一直担任后卫。赶到瑞金就接受了进攻会昌的命令。部队夜间即开始行动，因为道路不熟，走错了方向，发觉过来后急忙改道，赶到会昌城外时，枪炮声已经十分激烈了。
周士第立即将部队展开，按照指挥部赋予的任务给各团区分了任务。75团率先发起攻击，以突然的动作夺取了一个山头，占领了有利的阵地。73团不甘落后，连续占领了几个山头后，就向2531高地以北的几个重要山头猛攻。这几个山头是会昌城西北的屏障，是敌人的主阵地，敌人在这一带构筑了许多坚固的工事，火力配备很强。73团组织了几次进攻，都遭到顽强抵抗。
周士第站在山头上观察部队进攻情况，只见敌人依托工事，以密集的火力向我军攻击部队射击，几个战士中弹倒下了，又有几个战士倒下了，但部队仍然冒着弹雨冲上前去，一步步逼近敌人……见此情景，周士第不禁想到一年前这个团队（叶挺独立团）在河泅桥、贺胜桥，在武昌城下奋勇作战的情形来。多么勇敢坚强的部队啊，就是凭借着这股压倒一切敌人的勇气，才战胜了一股又一股强敌。
25师加入战斗后，我军各部又向敌人展开进攻。激战到下午，各部都有些进展。周士第在指挥所看见当面之敌已有些人渡河逃跑了，他判断敌人军心已经动摇，便命令师部司号员吹响了冲锋号。随着师司令部的号声，各团、营、连的冲锋号声接连吹响，震撼了整个山岗。
经过反复冲杀，25师攻下了敌人的主阵地，敌人向会昌城方面溃逃。刀团、74团迅速向会昌城追击。部队已经一天滴水未进了，又饥又渴，但官兵们忍着饥渴，继续战斗。在25师攻击的同时，24师也由城西面发起了进攻，下午4时，我军占领了会昌城。敌南路总指挥钱大钧及其残部仓皇逃跑。平日钱大钧行军打仗都是坐轿子，这时把轿子也扔了，自顾逃命，生怕起义军追赶上来。
战斗结束后，25师驻在会昌城南门外。
26日早上，周士第又接到叶挺军长、聂荣臻党代表的命令：援敌到了南山岭，正向会昌城开进，25师迅速向城西北出击。
情况来得突然，周士第接到命令时，枪声已经很近了。周士第见时间紧迫，便让李硕勋督促各团迅速出发，自己带着特务连先去城西北占领阵地。
刚刚登上城西北高地，就看见敌人也正向这个高地前进。周士第手一挥，特务连当即向敌人冲去，将敌人冲垮。特务连的行动赢得了时间，25师其他部队陆续赶来。每到一个部队，即展开占领一个阵地。后来又分几路向敌人出击，终于打退了敌人。
抓住俘虏一审，才知道袭击会昌的敌人，是桂系军阀的部队，他们不知钱大钧已被打垮，由洛口墟方向急匆匆赶来，却想不到碰上了硬钉子。
会昌战斗后，起义军折回瑞金，经河州、上杭进入广东。周士第的25师仍担任全军后卫，除掩护整个部队外，还负责掩护几百名伤病员和大批武器的转运。不久，起义军到达潮汕。第25师留在大埔县的三河坝，归朱德指挥。
三河坝位于梅江、汀江、韩江的会合口。25师驻在三河坝，如果发生战斗，就是背水作战，地形极为不利。于是，周士第下令部队移到三河坝对岸的东文部、笔枝尾山、龙虎坑、下村一带布防，师部驻在东文部。
我军刚刚部署完毕，那个被打跑的钱大钧又补充了10个团的兵力卷土重来。三河坝之战是南昌起义部队南下路上最惨烈的～仗，也是周士第所带的第25师最惨烈的一仗，许多年以后，那些活下来的老战士提及三河坝之战仍是神情黯伤。
在三河坝，我军顽强抵抗，一次又一次地粉碎了敌人强行渡河的企图，打沉了许多载运敌人渡河的船只。有的船上的敌人全被打死了，船无人掌舵，在河里团团打转。有些敌人挨打落水，活活淹死。
后来，敌军集中很多大炮和重机关枪向我军阵地猛烈射击，终于闯过河来。由于敌军势众，我军渐渐处于下风，守卫在笔枝尾山顶的75团第3营，在营长蔡晴）；！的指挥下，连续战斗了几天几夜，打退了敌人无数次进攻，杀伤许多敌人。终因敌众我寡，弹尽粮绝，在与敌人肉搏之后，全营官兵壮烈牺牲。
就在周士第率领第25师在三河坝与敌激战的时候，原被起义军占领的潮汕失守，起义军主力已经失败。由于当时通信联络手段落后，周士第等人并不知道这一消息，仍然认为坚守住三河坝就是对起义军主力最有力的支援，因此仍在三河坝与敌浴血奋战。一直激战三天三夜，东文部、笔枝尾山都被敌人占领，第25师处在了绝对优势敌人的三面包围之中。这时，周士第见再打下去就有可能全师覆没，于是决定退出战斗。
周士第带领着部队前去潮汕，想与起义军大部队汇合。走到半路上，遇见从潮汕退下来的起义军官兵，这才知道汕头、潮州已经被敌人占领了，起义军主力已经失败。
起义军南下失败后，周士第辗转于香港、南京、上海、西安、福建等地，其第25师的指战员则跟着朱德、陈毅几经艰苦转战，到达赣南。后来上了井冈山，与毛泽东领导的秋收起义部队会师，成为中国工农红军最初的来源之一。
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