中共三大虽然也通过了一个由毛泽东和谭平山起草的《农民问题决议案》，却没有花力气去具体组织实施。担任中央局秘书的毛泽东，一时也无暇去做。1924年12月，毛泽东离上海回湖南养病。第二年春夏，在老家湘潭韶山冲发动农民运动，开展“平粜阻禁”和“减轻租额”等斗争，并调查了农村社会各阶级的情况。毛泽东的活动，引起土豪劣绅的忌恨，湖南省省长赵恒惕电令湘潭县团防局急速逮捕毛泽东。在群众的保护下，毛泽东到了广州，随后担任国民党中央宣传部代理部长，开展对国民党右派的斗争。经过调查和斗争，毛泽东于12月1日在《革命》第四期上发表《中国社会各阶级的分析》一文。文章一开头就指出：“谁是我们的敌人？谁是我们的朋友？这个问题是革命的首要问题。”毛泽东写了这篇文章以后，即进入1926年。随着国共两党斗争的激化，特别是北伐战争的开展，和南方工农运动的蓬勃掀起，毛泽东与陈独秀的分歧也就逐渐尖锐起来。
①《中共中央政治报告选辑》，第133、134页，中共中央党校出版社1981年版。
1926年1月，在共产党和国民党左派掌握的国民党二大上，毛泽东与广东区委准备削弱右派的力量，在国民党中央委员的选举中，排挤右派。但陈独秀与国际代表执行莫斯科关于联合新右派反帝的路线①否定了毛泽东等人的计划。结果，在选举出的国民党中委中，共产党员只有7，名，左派14名，右派和中派却有15名。在中央监委中，共产党员只有一名，右派占了绝对优势，使国民党中委和监委联席会议时，造成左派孤立，右派势大，中派壮胆的局面。
1926年3月20日，蒋介石制造“中山舰事件”，排挤打击参加国民党军政部门的共产党员。毛泽东与当时在广州的陈延年、周恩来为首的中共广东区委，主张联合当时尚未附蒋的其他国民党军事力量进行反击，被在华访问的苏联共产党代表团否定，满足了蒋的要求。陈独秀在上海得知消息后，起先束手无策，尔后一面根据党内群众广泛的要求，准备反蒋，一面请示莫斯科，再次要求共产党退出国民党。共产国际指示在京准备回国述职的鲍罗廷返回广州，执行向蒋妥协的方针，并批评陈独秀退出国民党的提议。陈独秀退而积极执行妥协政策，写了给蒋的信和文章，表示拥蒋，引起毛泽东及广东区委的不满。但毛泽东等也不得不表示服从国际和中央的方针。
由于毛泽东在研究和从事农民运动上的杰出贡献，1926年2月5日，他成为新成立的国民党中央农民运动委员会委员。11月上旬，他又成为中共中央农民运动委员会书记。在他的指导下，当时湖南的农民运动已经发展到打倒土豪劣绅，建立农民武装和农民政权，突破减租减息，要求重新分配土地的阶段。因此，国共两党在农民问题上的矛盾也尖锐起来。在12月中旬汉口召开的中共中央特别会议上，毛泽东支持湖南区委提出的进行土地革命、解决农民土地问题的主张。但掌握会议的陈独秀、鲍罗廷和维经斯基对形势的估计落后于实际，不赞成马上解决土地问题，认为“土地还未成问题，目前的农民问题是减租减息”，并提出不应以赞成不赞成解决土地问题作为是否革命的标准。会议最后根据陈独秀的政治报告，通过决议，强调为了改善国共关系，中共对于农民运动的指导，只能“向政府（尤在军事领袖）要求帮助农民斗争”；规定党在农民问题的策略是：限制农民运动发展，反对“耕地农有”。①之所以要这样做，其目的是想换取蒋介石由右向“左”、扶持汪精卫取得国民党领导地位以制约蒋介石的军事势力。实际上，以牺牲工农根本利益去迁就蒋介石代表大地主大资产阶级的反动要求。这次会议标志着陈独秀右倾投降主义路线的形成。毛泽东在这次会议上，同陈独秀第一次进行了面对面的交锋。
毛泽东深深懂得，要求国民党“军事领袖帮助农民斗争”，只能是与虎谋皮。所以这次会议后，他没有被共产国际和党中央的错误路线所束缚。12月17日，他从汉口到长沙，仍按他的思想领导了湖南省第一次农工大会。大会通过了毛泽东起草的宣言和决议案，提出农民运动的根本目标是“根本铲除土豪劣绅的封建政权”。并指出：“农民在乡村中打击土豪劣绅，虽所取手段出于法律之外，其实这是革命争斗中所必取的手段。这时候，不是东风压倒西风，就是西风压倒东风，怎能不严厉一点？若是骇怕‘纠纷’，采取怀疑或反对的态度，这不算是革命党”①。但在具体政策上，毛泽东又不得不执行中共中央12月会议的决议。他在大会讲话中指出：“我们现在还不是打倒地主的时候，我们要让他一步，在国民革命中是打倒帝国主义、土豪劣绅，减少租额，减少利息，增加雇农工资。”②
①参见《关于中国共产党对待国民党的策略的报告》，1926年。
①《中共中央文件选集》（2），第389、401页。
为了回答国民党对农民运动的责备和刁难，同时也是为了说服党中央纠正右倾错误，1927年2月16日，毛泽东在湖南考察农民运动一个多月之后，写报告给陈独秀，主张中央“在农民运动中采取新路线”，指出“从前我们对农运政策上处置上几个颇大的错误点”。紧接着，他花了两天时间，写出《湖南农民运动考察报告》的主题部分，即第一章和第二章的前两节，以明确而尖锐的观点，歌颂农运“好得很”，不是“糟得很”；贫农是“革命先锋”，不是“痞子”，并论述了农民运动在完成这次伟大革命中的重要地位，指出“矫枉必须过正”，推翻封建阶级几千年积累的权力，农民的行动“过分一点也是对的”。18日，此报告即送给党中央机关报《向导》，紧接着又送了报告的其余部分，即14件大事。3月12日，《向导》即刊出报告的主题部分，而14件大事没有继续刊登出来。4月份，中央主管宣传的瞿秋白为毛泽东的全部报告出了单行本，并为此书写序，表示很赞赏。据瞿秋白夫人杨之华回忆：瞿秋白要彭述之将《考察报告》全部登完，彭不予同意，才在瞿的主持下出了单行本。五六月份，共产国际俄、英两种文字机关报《共产国际》先后转载了《向导》刊印的这个报告。应该说，共产国际是十分重视这个报告的。
接着，中共中央就任命毛泽东为中央农委书记，给了他领导全国特别是南方数省农民运动的权力和机会，使他很快成为全党著名的农民运动领袖。
但是，陈独秀由于他的特殊地位，必须执行国际的维持国共合作的路线，却处在一种极端矛盾的状态：一方面，广大农民群众和像毛泽东这样的农运干部要求彻底的土地革命；另一方面，是大多数地主家庭出身或与土豪劣绅有联系的国民党领导人和北伐军官因被冲击而反对土地革命。共产国际的指示也是，既要求支持土地革命，又要求不使国共合作破裂。陈独秀受到两面夹击，惶惶不可终日。
毛泽东于4月2日被国民党中常委第五次扩大会议确定为土地问题委员会成员。在出席土地委员会第一、二次会议后，19日又出席第一次扩大会议。这次会议听取湖南、广东和北方等代表关于农民运动状况和农民对土地要求的报告。毛泽东提出解决土地问题应有一个纲领，内容包括：（一）解决土地问题的意义；（二）土地没收的标准和分配的方法，这是解决土地问题的中心问题；（三）农民以什么政权机关来没收和分配土地；（四）禁止买卖土地和土地国有问题；（五）征收地税问题。在翌日举行的第二次扩大会议上，毛泽东发言说，没收土地为解决土地问题的中心问题。解放农民不仅包括现在耕种受痛苦的农民，也包括士兵在内。会议采纳毛泽东所提的意见，决定由邓演达、毛泽东、岳尔克（苏联顾问）和湖南、湖北两省农协代表各一人组成五人专门委员起草解决土地问题的方案。
①《湖南省第一次农民代表大会宣言》（1926年12月），《中共中央文件选集》（12）第408—409页。
②《湖南工农代表大会日刊》，1926年12月21日。
22日，毛泽东出席第三次扩大会议，国民党中央党部、国民政府的主要负责人汪精卫、谭延闿等也出席。邓演达代表五人专门委员会作关于《解决土地问题决议草案》的报告。他说：解决土地问题“原则上是平均地权，耕者有其田，以至土地国有”；为适应农民迫切要求使联合战线不受危害，在步骤上分为两步，第一步实行“政治的没收”，第二步实行“经济的没收”。毛泽东对草案作补充说明：土地问题必须解决，解决土地问题于全国革命有利益的。现在所决定的政治没收，是没收土豪劣绅军阀等等的土地，此为第一步；进一步再没收一切不耕种而出租于他人的土地，此为经济没收。经济没收在湖南已不成问题，农民已经自己分配。专就湖南的状况来说，用政治没收的形式是不够的，但就一般而论，只能用政治没收。所以，国民政府应明定一般的法规，同时又须颁行单行的法规，如湖南。毛泽东还说，自耕农、中农的土地不没收，富农是要没收的。参加会议的汪精卫表示反对“决议草案”，认为这个草案是以政治没收为名，行经济没收之实，因为一切大、中、小地主都可加以反革命头衔而没收其土地。24日的第四次扩大会议，继续讨论土地没收和分配问题，毛泽东发言只得同意全部（包括湖南）用政治没收的办法解决土地问题；同时指出，须再加以限制，说明界限，没收土豪劣绅军阀反革命派的土地是无人反对的。
然而，在26日举行的第五次扩大会议上，应邀出席的陈独秀和鲍罗廷只表示原则上赞成这个政治没收的办法，却提出还不能马上实行。他们强调，解决土地问题需先有农民政权；需先由国民政府农政部规定具体办法，由各省依据当地情况实施。这就等于连政治没收也取消了。因为国民党掌握的国民政府是不准备解决土地问题的。汪精卫则在第六次土地会议上表示，解决土地问题，必须在全国统一之后。
在这种情况下，中共五大在武昌召开，大会批评了陈独秀的右倾错误。毛泽东向大会提出了一个农民运动决议案，建议广泛地重新分配土地。但是，未被采纳，甚至未予讨论。毛泽东后来归罪于陈独秀支配下的党中央。其实，陈独秀在五大上虽然与鲍罗廷共同主张“先扩大，后深入”的方针，即先北伐打到北京，再进行土地革命。但当时因国际准备撤换陈独秀，掌握五大领导权的不是陈独秀，而是国际代表罗易等人。因此大会通过的决议，否定了陈独秀的主张，确认了政治没收的方针，但又强调实行这个方针必须通过国民党。结果，因国民党反对而落空。
就这样，在土地问题没有得到任何解决的情况下，中共五大因找不到合适的人选代替陈独秀，仍然选举他为总书记，毛泽东选为中央候补委员。两人虽然在对资产阶级国民党右派的斗争策略和农民问题上有分歧，但因都得服从国际的路线而没有决裂。
大革命面临失败危机，7月4日中共中央政治局常委举行会议，讨论如何保存农村革命力量，毛泽东列席会议。陈独秀在会上提出：农民协会会员和自卫武装可以利用国民军招兵机会加入，但要保存与农会的联系以维持其阶级性、革命性。毛泽东发言则说：关于省农协有两种策略：（一）改成安抚军合法存在，此条实难办到；（二）此外尚有两条路，（1）上山，（2）投入军队中去。“上山可造成军事势力的基础”。“不保存武力则将来一到事变我们即无办法”。
紧接着，共产国际虽然采取新方法，也无法挽回大革命的失败。此后，毛泽东与陈独秀也终于分道扬镳了。
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